CCK-8细胞增殖及毒性检测试剂盒

一 、 制作标准曲线 ( 测定细胞具体数量时)

1、先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，然后接种细胞。

2、按比例依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度，一般要做 3-5 个细胞浓度梯度，每组 3-6 个复孔。

3、接种后培养细胞贴壁，然后加试剂培养一定时间后测定 OD 值，制作出一条以细胞数量为横坐标(X 轴) ，OD 值为纵坐标(Y 轴)的标准曲线。根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量(试用此标准曲线的前提是实验的条件要*，便于确定细胞的接种数量以及加入后的培养时间。 )

二 、 细胞活性检测

1、在 96 孔板中接种细胞悬液(100µL/孔) 。将培养板放在培养箱中预培养(在 37℃,5% CO 2 的条件下) 。

2、向每孔加入 10µL溶液(注意不要在孔中生成气泡，它们会影响 OD 值的读数) 。

3、将培养板在培养箱内孵育 1-4 小时。

4、用酶标仪测定在 450nm 处的吸光度。

5、如果暂时不测定 OD 值，打算以后测定的话，可以向每孔中加入 10µL 0.1M 的 HCl 或者 1%SDS(W/V)溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。在 24 小时内吸光度不会发生变化。

三 、 细胞增值- 毒性检测

1、 在 96 孔板中配置 100 µL 的细胞悬液。 将培养板在培养箱预培养 24 小时 (在 37 ℃， 5% CO2 的条件下) 。

2、 向培养板加入 10µL 不同浓度的待测物质。 在培养箱孵育一段适当的时间 (例如： 6、 12、 24 或 48 小时) 。

3、向每孔加入 10 µL溶液(注意不要在孔中生成气泡，它们会影响 OD 值的读数) 。如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加之前更换新鲜培养基(除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基) ，去掉药物影响。

4、将培养板在培养箱内孵育 1-4 小时。

5、用酶标仪测定在 450 nm 处的吸光度。

6、如果暂时不测定 OD 值，打算以后测定的话，可以向每孔中加入 10µL 0.1M 的 HCl 或者 1%SDS(W/V)溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。在 24 小时内吸光度不会发生变化。

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